Grande parte da rotina do cientista é planejar e realizar experimentos.
A combinação de técnicas de laboratório auxiliará a responder à maioria das questões propostas pelos cientistas, e o fluxo de trabalho para sugerir novos métodos depende da formação e experiência do cientista.
Para os biólogos, as imagens de células podem dizer muito sobre o que está acontecendo com os processos e mecanismos que estão estudando.
A microscopia de luz é uma técnica muito difundida nas ciências biológicas
O uso de corantes, anticorpos e sondas fluorescentes permite que os cientistas vejam nas células do microscópio imagens do que, de outra forma, era muito pequeno para ser visto e até mesmo compreendido.
Microscópios de fluorescência e o uso de fluorocromos tornaram-se possíveis em 19301, e hoje muitas combinações de fluorocromos são possíveis para corar proteínas, organelas e estruturas dentro de células e tecidos.
Os fluorocromos (ou fluoróforos) são moléculas que, quando excitadas com um comprimento de onda de luz específico, emitem luz de um comprimento de onda definido que será capturada pelas lentes de um microscópio e transformada em uma imagem real.
A combinação de fluorescência, lentes e câmeras nos permite obter uma imagem dos processos dentro das células em muitos pontos de vista e aspectos diferentes.
Por exemplo, usando o microscópio, temos uma visão mais ampla de uma fatia do cérebro de camundongo em uma objetiva 2,5x ou 4x e pequenos detalhes do citoesqueleto de actina marcado na mesma amostra usando uma objetiva 63x.
Para possibilitar esses ensaios, podemos usar anticorpos ou corantes para proteínas específicas presentes na célula ou tecido, e um anticorpo que geralmente vem com um fluoróforo
O deslocamento de Stokes explica esse fenômeno: os fluoróforos perdem energia vibracional na forma de luz emitida quando mudam de um estado excitado de volta ao estado fundamental. Os microscópios de fluorescência fornecerão a luz para excitar o fluoróforo e receber sua luz emitida por eles. A luz emitida pode ser capturada por uma lente, processada dentro de uma câmera CCD e transformada em uma imagem digital.
Mas vamos falar sobre aquisição de imagem celular em outro momento. Agora, devemos apresentar a você exemplos e dicas para as principais etapas antes de adquirir sua imagem.
Como podemos escolher e combinar diferentes tipos de corantes e anticorpos, para ver e compreender as relações entre organelas e proteínas dentro das células ou tecidos?
Primeiro, os cientistas precisam determinar quais anticorpos e corantes usar com base em suas pesquisas
Por exemplo, neste artigo, a Dr. Mendonça estava tentando avaliar os efeitos e riscos potenciais de nanopartículas lipídicas sólidas catiônicas (cSLNs) em ratos. Muitas nanopartículas são desenvolvidas e estudadas todos os anos, com o objetivo de melhorar a entrega de medicamentos ou genes para o tratamento de muitas doenças. Uma das questões interessantes neste estudo era se as nanopartículas eram capazes de atingir o cérebro cruzando a barreira hematoencefálica. Esta barreira protege nosso cérebro de toxinas circulantes ou patógenos e, geralmente, não é desejável que moléculas cruzem a barreira. Mas, neste caso específico, o objetivo da Dr. Mendonça era que as nanopartículas cruzassem a barreira e chegassem ao cérebro, para entregar drogas ou genes em uma aplicação futura.
Querendo ver se as nanopartículas estavam presentes no parênquima cerebral, os autores usaram um marcador de células endoteliais para os vasos chamado RECA-1 (representado em vermelho), enquanto os núcleos das células foram corados com um corante azul chamado DAPI (4 ′, 6-diamidino -2-fenilindol). Também podemos observar pequenos pontos verdes para as nanopartículas fora dos vasos, o que significa que elas atingiram o parênquima cerebral.
Confira o infográfico abaixo com uma imagem de representação.
Vamos entender o que o anticorpo para RECA-1 (vermelho) está fazendo.
Esses anticorpos são projetados para servir como sondas específicas e têm como alvo um antígeno específico (em nosso caso, a proteína RECA-1).
Eles podem ser marcados com um fluoróforo ou reconhecidos posteriormente por um anticorpo secundário ligado a um fluoróforo.
Portanto, após excitar a amostra com uma fonte de luz, a proteína específica que você está procurando será reconhecida em sua amostra pela emissão de luz em um comprimento de onda específico.
No caso do DAPI, esse corante é a contracoloração dos núcleos e do nucleossomo e emite fluorescência azul ao se ligar às regiões AT do DNA.
Como projetar um painel para imunofluorescência?
Comece com estas etapas:
- Compre (ou peça emprestado! A ciência deve ser muito colaborativa!) Anticorpos e corantes essenciais para sua pesquisa. Dê preferência a anticorpos primários (sem sondas) e compre anticorpos secundários específicos para a espécie hospedeira do anticorpo primário. Por exemplo, se estiver usando um anticorpo primário produzido em coelhos, use um anticorpo secundário para anti-coelho. Isso vai garantir a especificidade.
- O uso de anticorpos secundários marcados com fluoróforos aumentará seu sinal, detectando mais antígenos por anticorpo primário. Além disso, é uma forma mais dinâmica de elaboração de diferentes ensaios, pois permite ao pesquisador modificar as cores do painel de acordo com suas necessidades.
- Outra etapa importante é verificar em seu microscópio quais filtros estão disponíveis para uso. Você deve certificar-se de que os comprimentos de onda de excitação e emissão do fluoróforo estão dentro dos filtros de excitação e emissão; caso contrário, você não conseguirá capturar a luz de emissão de suas sondas. Você pode usar o Fluorescence Spectra Viewer para verificar a compatibilidade.
- Para garantir que os comprimentos de onda de excitação e emissão de todos os seus fluoróforos e corantes não se sobreponham no mesmo ensaio, o Fluorescence Spectra Viewer é uma ótima escolha. Eles cobrem quase todos os fluoróforos disponíveis!
Finalmente, verifique um exemplo de um experimento hipotético em que temos Hoechst 33258 para os ácidos nucleicos e um anticorpo primário contra RECA-1 marcado com um anticorpo secundário Alexa Fluor 647.
Idealmente, usaríamos um microscópio disponível com um cubo DAPI (excitação 377/50 e emissão 447/60) e um cubo CY5 (excitação 628/40 e emissão 685/40). Todas essas informações foram inseridas no Fluorescence Spectra Viewer e obtivemos os espectros para ambos os corantes, e as larguras de banda para ambos os cubos (confira o espectro no infográfico acima).
Este ensaio hipotético é um bom exemplo de onde os espectros dos fluoróforos pertencem aos filtros de excitação e emissão, possibilitando ao pesquisador capturar suas amostras da melhor maneira possível.
Agora é hora de ir para o laboratório e colocar tudo em prática!
Espero que essas dicas ajudem você em sua próxima experiência de laboratório. Boa sorte!
References: